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KAPA建庫產(chǎn)品助力2019-nCoV病毒宏基因組研究

更新時間:2021-02-04 點擊次數(shù):1887
 

2019-nCoV疫情牽動著每一個人的心,目前除了一線疫情確認在進行大量檢測之外,溯源、復(fù)核、監(jiān)控疫情病毒變異的工作也在同步開展,在短期內(nèi),中國科學家以非凡的速度,分離并解析了病毒全基因組序列,為進一步分析其傳染機理傳播途徑,藥物靶點等提供了支持,這一切的工作都離不開基于高通量測序的宏基因組病原體檢測。

 

宏基因組測序(mNGS)解析

 

 

 

 

宏基因組病原體檢測是對感染樣本進行文庫構(gòu)建和高通量測序,通過病原數(shù)據(jù)庫比對,獲得致病微生物的種屬信息,對未知病原或已知變異較大病原進行識別,為傳染病防控帶來新的思路并提供指導(dǎo)臨床治療的報告。

 

根據(jù)提取核酸的種類不同,宏基因組病原體檢測分為DNA檢測流程和RNA檢測流程。

  1. DNA檢測流程適用于胞內(nèi)寄生的細菌如結(jié)核分枝桿菌、細胞壁較厚的真菌如隱球菌等病原的檢出。

  2. RNA檢測流程適用于流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒等RNA病毒的檢出。本次病毒鑒定即是通過宏基因組測序RNA流程進行的。

?

 

 

 

01

 

宏基因組測序的臨床應(yīng)用

 

 

 

 

病原檢測:未知病原微生物增加了臨床診斷難度,無法進行有效治療,導(dǎo)致患者病情加重甚至死亡?;诤昊蚪M學的測序在未知病原檢測中發(fā)揮日益重要的作用。

 

病原監(jiān)測與溯源:對特定地區(qū)或人群的臨床樣本進行宏基因組學測序,監(jiān)測潛在致病病原,對可能出現(xiàn)的疫情進行預(yù)測預(yù)警,對病原進行追溯,找到潛在傳播途徑,及時確定和切斷傳染源。

 

 

 

 

02

 

宏基因組測序面臨的挑戰(zhàn)

 

 

 

 

高通量測序病原宏基因組檢測的前處理環(huán)節(jié)只涉及核酸提取和測序文庫構(gòu)建,不存在病原培養(yǎng)中出現(xiàn)的時滯,在病原微生物的檢測中有著明顯的優(yōu)勢,能夠更好應(yīng)對臨床病原診斷需求,但是也依然面臨不少挑戰(zhàn),其中,測序文庫構(gòu)建關(guān)鍵并且難度大。

 

先天不足:病原樣本深藏在大量宿主和其它微生物之內(nèi),臨床病原常為起始量低,背景噪音大的復(fù)雜樣本,大量宿主信號掩蓋了微量病原信號,致使敏感性偏低,難以有效區(qū)分。

 

后天潛憂:文庫構(gòu)建涉及到基因組打斷,測序接頭鏈接,全基因組擴增等多個步驟,每一步驟的目標是要每個分子都以相同的效率執(zhí)行每個步驟,打斷有損失,連接有差別,擴增有偏好,都會帶來檢測誤差。

 

 

 

 

03

 

宏基因組檢測失敗的原因

 

 

 

 

  1. 核酸機械打斷,損失較大,導(dǎo)致潛在病原信息丟失

  2. 連接效率較低,文庫構(gòu)建中核酸分子多樣性和文庫復(fù)雜度的丟失,導(dǎo)致假陰性結(jié)果

  3. 建庫過程PCR步驟,特別是GC含量較高和較低的區(qū)段,擴增不均一,覆蓋不到位

 

 

 

 

04

 

眾志成城 共克時艱

文庫構(gòu)建在宏基因組病原檢測中重要的指標是核酸分子的復(fù)雜度和成庫產(chǎn)物的均一度,既要保證痕量目標病原的存在,又要保證目標病原不會因擴增過程的不均勻性比例過低,在后續(xù)測序中被遺漏。

 

KAPA宏基因組測序產(chǎn)品應(yīng)用方案解析

 

 

 

 

宏基因組DNA檢測流程:KAPA Hyperplus酶切法DNA文庫構(gòu)建試劑盒,無需機械法打斷儀器,樣本損失量小,操作簡單,可根據(jù)測序長度,進行片段大小調(diào)整,同時提供了更高的轉(zhuǎn)化效率及更低的擴增偏差(KAPA HiFi),從而獲得更均一的全局序列覆蓋度。

宏基因組RNA檢測流程:正常起始量樣本,推薦采用KAPA核糖體RNA去除試劑盒 (人/大鼠/小鼠)去除宿主rRNA,之后采用KAPA RNA Hyper文庫構(gòu)建試劑盒進行文庫構(gòu)建。對于微量樣本,則推薦利用SMART-seq2方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用KAPA HiFi擴增cDNA,擴增后的cDNA再采用 KAPA DNA Hyperplus進行DNA文庫構(gòu)建。

 

KAPA DNA和RNA建庫產(chǎn)品目前已廣泛應(yīng)用在宏基因組病毒測序中,可參考文末文獻引用[4][5]。

 

 

 

 

05

 

KAPA產(chǎn)品應(yīng)用亮點

 

 

 

 

 

  1. 復(fù)雜臨床病原樣本建庫效率高,確保病原的獲得[2]

  2. 文庫擴增覆蓋度、均一性好,PCR 重復(fù)度低,使得各種GC含量的病原均衡富集[1]

  3. 宿主rRNA去除效率高,顯著減少背景噪音,將更多測序reads用于病原而非宿主[3]

  4. IVD級別質(zhì)控,產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定、批間差小,在大量各異的臨床樣本前表現(xiàn)穩(wěn)定

  5. 優(yōu)化建庫步驟,縮短實驗時間,快速獲得文庫用于后續(xù)測序[1]

  6. 完美兼容自動化工作站建庫方案,規(guī)模化應(yīng)對疫

 

 

 

 

 

06

 

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文獻引用

1. Aigrain, L., Gu, Y., & Quail, M. A. (2016). Quantitation of next generation sequencing library preparation protocol ef?ciencies using droplet digital PCR assays-asystematic comparison of DNA library preparation kits for Illumina sequencing. BMC genomics.

2. Ring, J. D., Sturk-Andreaggi, K., Peck, M. A., & Marshall, C. (2017). A performance evaluation of Nextera XT and KAPA HyperPlus for rapid Illumina library preparation of long-range mitogenome amplicons. Forensic Science International: Genetics.

3. Herbert, Z. T., Kershner, J. P., Butty, V. L., Thimmapuram, J., Choudhari, S., Alekseyev, Y. O., ... & Gillaspy, A. (2018). Cross-site comparison of ribosomal depletion kits for Illumina RNAseq library construction. BMC genomics.

4. Deng, Y., Cai, W., Li, J., Li, Y., Yang, X., Ma, Y., ... & Sun, M. (2019). Evaluation of the genetic stability of Sabin strains and the consistency of inactivated poliomyelitis vaccine made from Sabin strains using direct deep-sequencing. Vaccine.

5. Grubaugh, N. D., Ladner, J. T., Kraemer, M. U., Dudas, G., Tan, A. L., Gangavarapu, K., ... & Prieto, K. (2017). Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature.

 

僅供科研使用,不得用于診斷

 

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