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神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基的作用

更新時間:2015-08-20 點擊次數(shù):1319
     神經(jīng)干細胞是具有多潛能性的細胞,它具有分化成有限細胞類型和構建組織的能力。目前已知,神經(jīng)干細胞在體外特定的條件下可被誘導分化為神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。筆者在試驗時曾取小鼠中腦神經(jīng)干細胞在體外進行誘導分化,為證實其多分化潛能,在撤掉絲裂原并加入血清分化1周后,對細胞進行免疫組織化學鑒定,發(fā)現(xiàn)分化的細胞中有神經(jīng)元特異性烯醇化酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、和小膠質(zhì)細胞特異性抗原標志Gal-C陽性緗胞。此三種細胞已成為鑒定神經(jīng)干細胞分化能力的特異性指標。
    目前,神經(jīng)干細胞的分離方法主要有三種:無血清培養(yǎng)基自然篩選法、流失細胞術分選法、免疫磁珠分選法。下面重點介紹下我們公司采用的無血清培養(yǎng)基自然篩選法。
    無血清培養(yǎng)基自然篩選法是迄今應用,也是zui簡單和容易操作且行之有效的方法。其原理是利用特殊的培養(yǎng)基使成熟的神經(jīng)細胞無法較長時間地成活,而分離篩選出能夠在該培養(yǎng)條件下存活并增殖的神經(jīng)干細胞群體。首先將含神經(jīng)干細胞的神經(jīng)組織通過機械或酶解分散等方法制備成單細胞,然后培養(yǎng)于含有特殊營養(yǎng)添加劑和促增殖因子的不含血清的培養(yǎng)液中。非神經(jīng)干細胞在這種培養(yǎng)系統(tǒng)中由于營養(yǎng)缺陷無法較長時間地存活,而神經(jīng)干細胞則適應該培養(yǎng)體系并在促增殖因子作用下生長增殖。因此,經(jīng)過培養(yǎng)一段時間之后,就可獲得通過這種自然篩選而增殖形成的呈神經(jīng)球狀生長的神經(jīng)干細胞群體。這種利用特殊培養(yǎng)基自然篩選神經(jīng)干細胞方法的優(yōu)點是:簡便易行,不需要特殊的儀器設備等條件,分離效率高,神經(jīng)干細胞損傷小易于成活。
    神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng),選用合適的體外培養(yǎng)條件至關重要。目前,常規(guī)使用的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基為DEME/F12(1:1)加上無血清營養(yǎng)添加劑B27和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),也有應用添加劑N2或表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)等。在此培養(yǎng)體系中神經(jīng)干細胞呈神經(jīng)球狀生長,即增殖的細胞不貼附于培養(yǎng)器皿上,而是圓形的細胞彼此黏附在一起形成小球狀懸浮于培養(yǎng)液中生長。當采用一些方法將其分散成單細胞后,既可由單個細胞增殖成神經(jīng)球,也可由數(shù)個細胞重聚集后形成小神經(jīng)球結構,然后小神經(jīng)球再增殖成較大的神經(jīng)球。這些神經(jīng)球中,外周的細胞為新增殖的細胞,生長較為旺盛,而在神經(jīng)球中央,特別是直徑較大的神經(jīng)球可見到有一些細胞出現(xiàn)凋亡或壞死,有部分可發(fā)生自主分化,表現(xiàn)為帶短突起的細胞。所以,當神經(jīng)球長到一定大小要及時傳代。
    要維持神經(jīng)干細胞在體外生長,在培養(yǎng)體系中需要加入絲裂原來促進其增殖,大多數(shù)采用bFGF。適當濃度的bFGF可使神經(jīng)干細胞的增殖能力達到zui大,但高濃度卻會促進神經(jīng)干細胞的分化。
    神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)另外很重要的一點就是如何盡量讓其少分化或不分化,除了神經(jīng)干細胞本身的特性決定了一部分不對稱分裂的細胞必將發(fā)生自主分化外,培養(yǎng)條件對神經(jīng)干細胞的分化與否影響很大,比如在培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),將神經(jīng)干細胞球培養(yǎng)于塑料器皿,其黏附于器皿表面并發(fā)生分化的可能要比培養(yǎng)于玻璃器皿的高很多。另外,某些底物如多聚賴氨酸或多聚尿氨酸、作為細胞外基質(zhì)的的層黏臉蛋白、膠原等都能在無特殊誘導劑存在的情況下,促進神經(jīng)干細胞的貼壁而分化。神經(jīng)干細胞在體外分化的形態(tài)表現(xiàn)為由圓形變成帶有明顯突起、形態(tài)各異的神經(jīng)細胞,懸浮的神經(jīng)球出現(xiàn)貼壁呈圓盤狀,形態(tài)各異的細胞向周圍呈放射狀長出并遷移,甚至全部細胞均分化平鋪于器皿上生長。培養(yǎng)液中bFGF除了對神經(jīng)干細胞的分裂增殖起著關鍵的作用外,對神經(jīng)干細胞分化的作用也很重要。當培養(yǎng)液中撤除bFGF時能夠?qū)е律窠?jīng)干細胞的分化,但較高濃度的bFGF卻也能促進神經(jīng)干細胞的分化。
    

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